微生物限度检查不会做？一文看懂完整流程

      微生物限度检查是药品、化妆品、食品、医疗器械等非无菌产品质量控制的核心项目，用于判断产品微生物污染程度是否符合标准、是否存在致病菌。很多新手觉得步骤繁琐、细节难记，其实只要按环境准备→样品制备→微生物计数→控制菌检查→结果判定五步走，就能规范、高效完成全流程。本文结合药典要求与实验室实操，用通俗语言讲清每一步要点，新手也能快速上手。
      一、实验前准备：环境、耗材与无菌操作
      微生物限度检查必须在局部洁净度不低于B级的单向流洁净台内进行，全程严格无菌操作，防止外源污染。
      1.环境与设备
      洁净台提前开机自净30分钟，培养箱、天平、均质器、滤膜过滤器等提前校准；实验服、口罩、手套穿戴规范，操作前用75%乙醇消毒双手与台面。
      2.培养基与稀释液
      常用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液作为稀释液；计数用**胰酪大豆胨琼脂（TSA）**测需氧菌总数、**沙氏葡萄糖琼脂（SDA）**测霉菌和酵母菌总数；控制菌检查用胆盐乳糖、麦康凯、营养琼脂等选择性培养基。所有培养基需验证适用性，确保合格。
      3.对照设置
      必须同步做阴性对照（稀释液代替供试液，应无菌生长）与阳性对照（接种标准菌株，应正常生长），两项合格实验才有效。
      二、供试液制备：不同样品统一处理逻辑
      供试液制备原则：1:10起步、均质充分、快速操作，从制备到接种不超过1小时，温度不超过45℃，避免微生物失活。
      1.通用步骤
      称取/量取供试品10g或10mL，加入90mL稀释液，用均质器拍打或无菌研磨，制成1:10供试液；如需更高稀释度，按10倍梯度逐级稀释至1:100、1:1000。
      2.特殊样品处理
      液体样品：直接稀释混匀；
      固体/片剂：研磨成细粉后再均质；
      油剂/软膏：加聚山梨酯80乳化，再制成均匀混悬液；
      有抑菌性样品：加入中和剂（如卵磷脂、吐温80）消除抑菌作用。
      三、微生物计数：测总数、判污染程度
      微生物计数分平皿法（最常用）与薄膜过滤法（适合抑菌样品），核心是准确统计菌落数。
      1.平皿法操作
      取不同稀释度供试液各1mL，注入无菌平皿，每个稀释度做2个平行；迅速加入冷却至45~50℃的培养基，轻轻旋转混匀，待凝固后倒置培养。
      2.培养条件
      需氧菌总数：TSA培养基，3035℃培养35天；
      霉菌和酵母菌总数：SDA培养基，2328℃培养57天。
      3.计数规则
      选择菌落数在30~300cfu的稀释级进行计数，取平行皿平均值，再换算成每g/mL的菌落数，结果保留两位有效数字。
      四、控制菌检查：排查致病菌、守住安全底线
      控制菌检查是“定性”检测，判断是否存在大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、沙门菌等有害菌，口服制剂必查大肠埃希菌。以大肠埃希菌为例：
      1.增菌培养
      取1:10供试液10mL，接种至100mL胆盐乳糖培养基，36±1℃培养24~48小时，观察是否浑浊。
      2.分离培养
      取增菌液划线接种麦康凯琼脂平板，36±1℃培养24~48小时，观察是否出现红色圆形、边缘整齐、周围有胆盐沉淀环的典型菌落。
      3.生化鉴定
      挑取疑似菌落做靛基质、甲基红等试验，确认是否为目标菌。
      全程阳性对照应检出、阴性对照无菌生长，否则实验无效。
      五、结果判定与报告：标准清晰、结论明确
      1.计数结果判定
      需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数均不超过标准规定限度，判为符合规定；任何一项超限，判为不符合。
      2.控制菌结果判定
      未检出目标控制菌，判为符合规定；检出即判不符合，不得复试。
      3.检验报告
      报告需注明样品信息、检验依据、稀释级、培养条件、菌落数、控制菌结果，最终明确符合/不符合微生物限度标准。
      六、新手常见误区与避坑要点
      1.培养基温度过高会烫死微生物，过低易提前凝固，严格控制45~50℃；
      2.洁净台内动作要轻，避免气流扰动带来污染；
      3.抑菌样品必须做中和处理，否则结果假偏低；
      4.对照试验不合格，无论样品结果如何均需重做。
      总结
      微生物限度检查看似环节多，实则逻辑清晰：先控环境、再制样品、先测总数、后查致病菌、对照把关、标准判定。只要严格遵循无菌操作与药典流程，做好每一个细节，就能稳定得出准确、可靠的结果。无论是日常检验还是GMP合规检查，这套流程都能直接套用，新手照着做就能少走弯路、快速达标。